什么是显微镜综合调节对比(IMC)?

霍夫曼调制对比已经确立了自己作为观察未染色,低对比度生物标本的标准。其创新的技术实施许可显著简单的处理和更大的灵活性。在现代倒置显微镜的光路调制器的集成允许使用范围广泛的明场或载物台的物镜,而不是一小部分的特殊物镜。现在,对比度可以修改和优化的单独使用自由接近调制器。

调节对比度

调节对比度是对比度增强的宽视场显微镜可以转换在未染色标本和活细胞光学梯度或斜坡入不同的光强度的方法。它是在1975年发明了由罗伯特·霍夫曼和采用狭缝板,使斜照明和调制器,用于光强度调制。由于样品的三维外观,在医学和生命科学的调节对比度的主要应用是类似ICSI和显微技术(胞浆内单精子注射)在IVF克隆和原核注射转基因。

在光路径中的特殊成分

在光路中的至少两个特殊的部件所必需的调节对比度的照明。以使斜光的狭缝板放置在聚光镜的前焦平面。其次,调制器被放置在物镜的后焦平面。调制器包含具有不同的光密度三个指定区域:一个透明区,一个具有15%的光的权限和一个用1%的光的权限。光通过调制器是通过定义所谓的调制。

除了上述组分含有偏振片的第二狭缝通常可以在滑动板中找到。在与位于显微镜的聚光镜的顶部,另一个偏振片组合,该偏振片可以用于控制有效狭缝开口(通过打开90°(暗)的位置),并启用缓解的效果。需要注意的是检体未允许的双折射塑料或玻璃容器雇佣的偏振器之间的位置。然而,偏振片不是调制对比度的先决条件。

徕卡显微镜什么是综合调节对比(IMC)?

图1:从聚光镜光通过该狭缝板的狭缝,以使偏斜照明。当光通过样品,这是在相变偏转(例如改变细胞膜的斜率)。随后,光被偏转到调制器产生一个浮雕状,三维图像的印象的不透明或透明的部件。 

 

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图2:当光通过它被调制在幅度调制器的不同区域。通常该区域具有(左到右)的1%,15%或100%的传输。

 

调制相差梯度转换成亮度渐变

细胞的许多部件导致通过固有特性的改变透射光的相位。这些性能可能是斜率和特定结构的陡度,获得修改折射率变化率或仅仅改变在给定结构的厚度的结构。由于这些性质(如单元厚度)通常在一定面积逐渐变化(而不是立即改变),光的相位的过这方面的变化也发生逐渐导致相位梯度。相梯度将衍射入射光引起的光的偏转角的变化。

由于所采用的调制相反的偏斜照明,在偏转的角度的变化可能大大受到影响,光将通过调制器在不同的区域相比,非偏转的光。在小区(s)表示,都或多或少均匀的斜率,陡度,厚度等的圈所产生的图像的区域将显示为灰色。同样情况也适用于图象的背景,因为光通过这些同质区域不会经历相移由于在检体相梯度和几乎不被偏转。(奥林巴斯显微镜)

在一个调制对比度系统的非偏转的光通过在用15%的光的权限的调制器的面积,导致灰的颜色为细胞(S)和背景的均质区域。当光通过引起的相移(例如改变细胞膜的斜率)的试样的区域中,光被偏转或者黑暗(1%许可)或调制器的透明(100%许可)的区域。作为试件是倾斜地照亮,该图像将出现从梯度从梯度的另一侧(在光被偏转到区域与(其中光被偏转到区域用1%许可)和亮的一侧较深100%的许可)。

徕卡显微镜什么是综合调节对比(IMC)?徕卡显微镜什么是综合调节对比(IMC)?

图3A,B:通过将相梯度为亮度梯度调节对比度可视化的透明,低对比度的标本。其结果是,高对比度的灰度级形成的创建三维图像的印象。(图3a礼貌C. Mehnert的,体外授精中心,德国吉森)

 

IMC提供了更多的自由

在综合调制对比度的情况下(IMC)的调制器的物镜以外的焦平面共轭到所述聚光镜(中间光瞳)的光束路径(图4)结合起来。调制器被安装在其上分别插入在支架上(图5)一侧的瞳孔间接口滑块。因此,它们是自由访问,并允许用户根据需要很容易地调节对比度。 除此之外,也可以使用调制器,具有不同的传输。滑块还设有用于调制的图像的位置明。用显微镜法团校董会已成立,以确保对比度(3D印象的影子方向)的方向是相同的所有物镜。 检体的空间印象改变物镜或放大倍数时因而保持不变,因此没有必要调整狭缝状光阑。

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图4:在徕卡的数码倒置显微镜IMC解决方案。该调制器可自由在中间光瞳为灵活调整物镜外部访问和定位的。狭缝状光阑定位在聚光镜瞳孔。

 

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图5:IMC滑块与在两个不同的光瞳位置调制器的光盘是容易使用,并允许单独调整。

 

脱开的调制器时的一个基本的考虑是,在物镜的后焦平面可以是45毫米齐焦距离的整个范围内的任何地方。因此,物镜的外部的调制器必须是可移动的至少该距离。多亏的徕卡物镜,这是由固定焦平面,部署在倒置显微镜和固定倍率步骤从5倍定义为63X的设计,有可能减少调制平面数两个瞳孔的位置(图6)。

光束路径的瞳孔,在所谓的中间光瞳的图像,被设计成一个1×望远镜系统。物镜背后的无限光路转载于中间的瞳孔。其结果是,平面平行的光的任何厚度的调节剂,也可以插入到在中间光瞳的光束路径,倾斜或未倾斜,而不损害图像的位置或质量。杂散和虚光由望远镜系统的最优单色和彩色校正以及IMC调制器的汽相淀积灰色和暗金属涂层的极低反射特性最小化。

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图6:徕卡物镜是通过固定的焦平面定义。由于它们在倒置显微镜和由于固定倍率步骤五倍63X的使用,有可能减少调制平面数两个瞳孔的位置。

 

独立可变参数

法团校董会提供充足的空间用于调制对比度个别调整。该调制器是垂直可调,以提供均匀的图像在任何时候。不同阶段或缓冲溶液的水平,并在检体盘的细胞的不同位置因此可以补偿。移动调制器横盘改变分辨率:进一步调制器和狭缝隔膜向外移动,更高的分辨率(最大分辨率RES =λ 2NA)。

两个调制器参数影响的对比度的强度:发送和灰色区的宽度。 降低传输增加对比度。 的25%的传输,例如,导致在光滑对比度。 具有大约10%的值时,对比度变显著更清晰。 改变调制器的宽度也同样有效(图7)。

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图7:横向可调调制器可变分辨率,裂隙隔膜额外的极化狭缝可调的浮雕效果。

 

缩小灰色区域的结果更清晰的对比,而宽调制器柔化整体形象的印象。法团校董会的狭缝隔膜有两个开口。第一狭缝上成像的调制器的灰色区域,产生用于调制对比度的偏斜照明。 第二狭缝覆盖有偏振箔(图7)。可旋转的偏振器定位在膜片的前面可以增加或减少的调制对比度3D效果。 用塑料盘工作时,由于光只偏振光在照明侧并没有分析器上使用物镜侧偏振片不影响图像质量。狭缝隔膜的尺寸相匹配的最常用的聚光镜。

因此IMC不仅适用于生物材料的常规检查 - 这也是一个很好的工具,为要求苛刻的应用,如显微操作,显微注射或显微解剖。

IMC的优点

众多优势使综合调节对比度的宽视场显微镜一个广泛使用的方法。 综合调节对比度可与放大倍数高达63X的物镜使用。不需要特殊的物镜,并具有较高的校正(如平场消色差和复消色差物镜)的物镜可以用于调制对比度。这使得优秀的具有良好的对比度和细节的可视性解决

调节对比度显微镜观察的另一个优点是,不像在微分干涉显微镜,塑料器皿和培养皿器具可以使用,如在光路中的偏振器位于所述样品之前。此外不需要沃拉斯顿棱镜。这导致对装有调节对比度显微镜适中的成本。

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